Tác giả: TS.BS. Trần Ngọc Tuấn
Người biên dịch: TS.BS. Nguyễn Đỗ Ngọc Linh
Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepato Cellular Carcinoma) đã trở thành nguyên nhân thứ hai gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới [1]. Thật không may là hầu hết các trường hợp HCC thường phát hiện muộn do không biểu hiện triệu chứng ở giai đoạn đầu và hiện nay chúng ta vẫn thiếu các phương pháp sàng lọc có độ nhạy cao và thuận tiện cho bệnh nhân. Các nghiên cứu từ trước đến nay cho thấy tỷ lệ sống sót sau một năm đối với HCC ở Hoa Kỳ là dưới 50%, còn tỷ lệ sống sót sau năm năm là 10% [2].
Gần đây, liệu pháp điều trị đối với viêm gan C mạn tính (HCV) ra đời và phát triển mạnh, nên tỷ lệ mắc toàn cầu của HCC liên quan đến HCV có thể giảm, tuy nhiên, tỷ lệ HCC liên quan đến bệnh gan [gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD)] và HCC liên quan đến viêm gan B (HBV) vẫn rất cao.
Chẩn đoán HCC có thể dựa trên hình ảnh chụp cắt lớp vi tính hoặc chụp cộng hưởng từ. Tuy
nhiên, sinh thiết mô vẫn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán HCC, đặc biệt ở những bệnh nhân không xơ gan hoặc những người có hình chụp không đặc hiệu. Nguy cơ rủi ro của biện pháp sinhthiết gan cũng khá nhiều, ví dụ như các biến chứng như đau, chảy máu và thủng các cơ quan lâncận, cũng như gieo rắc tế bào ung thư dọc theo đường kim và lỗi do kỹ thuật lấy mẫu dẫn đến kết quả âm tính giả. Ngoài những rủi ro này, những tiến bộ công nghệ trong vài thập kỷ qua đã giúp chúng ta hiểu hơn về tính không đồng nhất và sự tiến triển khác nhau của các tế bào khối u HCC, trong khi đó xét nghiệm sinh thiết gan bị hạn chế về thời gian và địa điểm sinh thiết, sẽ không đủ để phản ánh những thay đổi của tế bào ung thư. Chính vì thế, gần đây việc áp dụng phương pháp sinh thiết lỏng trong HCC ngày càng được quan tâm. Mặc dù khái niệm sinh thiết lỏng đã tồn tại trong nhiều thập kỷ, thuật ngữ này mới được quan tâm vào những năm 2000, với một trong những ứng dụng đầu tiên liên quan đến việc bắt các tế bào khối u lưu hành (circulating tumorcells – CTCs) để phân tích dấu ấn sinh học ở bệnh nhân ung thư vú [3] .
Sinh thiết lỏng thường liên quan đến việc phân tích máu hoặc các chất dịch cơ thể khác để có được thông tin có thể áp dụng trong sàng lọc, chẩn đoán, tiên lượng, theo dõi điều trị hoặc tái phát bệnh [4]. Ưu điểm chính của sinh thiết lỏng là không xâm lấn, cho phép chúng ta làm xét nghiệm thường xuyên để theo dõi các đột biến và các thay đổi phân tử khác theo thời gian. Huyết thanh chẩn đoán HCC được sử dụng phổ biến nhất là huyết thanh alpha-fetoprotein (AFP), cùng với fucosylated glycoform (AFP-L3). AFP thường được tạo ra bởi gan của bào thai và túi noãn hoàng trong thời kỳ mang thai và nó suy giảm nhanh chóng sau khi sinh. Sự tái sinh của các tế bào gan dẫn đến sản xuất AFP, nên chỉ số này thường tăng trong bệnh gan mạn tính và HCC. Các loại u ác tính khác, ví dụ ung thư tinh hoàn hoặc buồng trứng, cũng có thể gây tăng AFP.
Glycoform AFP-L3, được đặt tên cho khả năng liên kết Lens culinaris agglutinin, là một thử nghiệm tương đối mới được phát triển vào năm 1992, đặc hiệu hơn so với AFP, đối với HCC.[5]. Nồng độ AFP huyết thanh có thể bình thường ngay cả trong khi bệnh lý HCC đã tiến triển [6]. Trong hai báo cáo nghiên cứu trên khoảng 1800 bệnh nhân, AFP khoảng từ 10 đến 20 ng/mL có độ nhạy khoảng 60% và độ đặc hiệu 80% trong việc phát hiện HCC [7,8]. Nồng độ AFP huyết thanh quá cao không tương ứng với độ đặc hiệu với HCC, ví dụ AFP> 400 ng/mL chỉ ngụ ý HCC nhưng nó cũng xảy ra ở nhiều bệnh lý khác. Trường hợp HCC có mức AFP tăng cao như vậy chỉ dưới 20%[9]
Các dấu ấn sinh học huyết thanh và huyết tương có thể phát hiện được thông qua sinh thiết lỏng tỏ ra hứa hẹn trong việc phát hiện sớm HCC đơn thuần hoặc kết hợp với AFP. Những dấu hiệu này có khả năng hỗ trợ hoặc thậm chí vượt trội hơn so với các phương pháp chẩn đoán HCC thông thường. Tuy nhiên, các dấu hiệu này vẫn đang trong quá trình nghiên cứu và thử nghiệm tiền lâm sàng và chưa được khuyến nghị chẩn đoán HCC. Ở đây, chúng tôi muốn chia sẻ tóm tắt cập nhật về phân tích “axit nucleic không có tế bào” (circulating free nucleic acid – cfNA) trong chẩn đoán HCC, trong đó nhấn mạnh vào “DNA không có tế bào” (circulating free DNA – cfDNA).
Mẫu sinh thiết lỏng chứa thông tin di truyền trong tế bào khối u lưu hành hoặc ở dạng cfNA được giải phóng bởi các tế bào chết theo chu trình hoặc tế bào sống. cfNA có thể được tìm thấy lưu thông tự do trong chất lỏng cơ thể hoặc được đưa lên bởi các túi ngoại bào như exosome và microvesicles. Các loại cfNA khác bao gồm cfDNA, mRNA (cfRNA) và RNA không mã hóa bao gồm cả miRNA (cfmiRNA). Các RNA không mã hóa khác bao gồm RNA không mã hóa dài, RNA hạt nhân nhỏ, và RNA tương tác piwi cũng có thể có trong các mẫu sinh thiết lỏng và có khả năng đóng vai trò là dấu ấn sinh học mặc dù hiện tại có rất ít nghiên cứu về các loại dấu ấn sinh học phụ này.
Báo cáo đầu tiên về cfNA có nguồn gốc từ máu ngoại biên của con người đã được Mandel và
Metais [10] công bố vào năm 1948, tuy nhiên, ý nghĩa của nó đã không được nhận ra cho đến vài thập kỷ sau đó vào năm 1977 khi phát hiện ra rằng huyết thanh và huyết tương của bệnh nhân ung thư mang nồng độ cfDNA cao hơn so với người khỏe mạnh [11].
Khoảng một thập kỷ sau, Vasioukhin cho thấy cfDNA có thể có đặc trưng ung thư, cho thấy các tế bào ung thư có thể giải phóng DNA vào máu ngoại vi [12]. Khái niệm này đã sớm được xác nhận bởi các nhà điều tra khác [13,14] và cfDNA được các tế bào ung thư giải phóng vào lưu thông sau đó được gọi là DNA khối u lưu hành (ctDNA).
Phân tích cfRNA trong huyết thanh và huyết tương bị hạn chế bởi số lượng rất nhỏ có trong tuần hoàn máu cũng như sự thoái hóa gây ra bởi ribonuclease (RNase). Kết hợp cfRNA vào các túi ngoại bào giúp bảo vệ chúng khỏi sự thoái hóa này.
RNA không mã hóa, đặc biệt là cfmiRNA lần đầu tiên được chứng minh là một dấu ấn sinh học đầy triển vọng ở những bệnh nhân mắc bệnh ung thư tạng đặc vào năm 2008 [19]. Kể từ đó, đã có một số nghiên cứu về RNA không mã hóa trong các loại ung thư khác nhau bao gồm HCC [20].
Một bài báo gần đây đã lập bản đồ biểu hiện sự khác biệt của các RNA không mã hóa trong mô gan bình thường và trong các giai đoạn khác nhau của bệnh gan dẫn đến HCC; mỗi kiểu hình gan có một loại RNA duy nhất [21]. Sự hiện diện của các miRNA-21 và miRNA-10b ngoại bào trong HCC thúc đẩy sự tăng sinh và di căn tế bào ung thư, có khả năng phục vụ trong tiên lượng và điều trị cho HCC [22]. Một số cfmiRNA khác đã được nghiên cứu, bao gồm miR-1 [23], miR-16 [24-26] và miR-122 [23,27-29]. Một nghiên cứu chuyên sâu về miRNA lưu hành trong HCC nằm ngoài phạm vi của bài này.
Phân tích sinh thiết lỏng trong HCC đã phát triển đáng kể trong thập kỷ qua, cung cấp thông tin hữu ích về các khối u HCC khác nhau kể cả ở mức độ phân tử . Đây có thể là ứng dụng tiềm năng trong chẩn đoán và theo dõi bệnh.
Có một số thách thức trong việc tách chiết cfDNA nói chung và ctDNA nói riêng, bao gồm: DNA bị ly giải do kết quả của quá trình đông máu trong ống thu thập, nhiễm DNA trong quá trình xử lý hoặc mất DNA trong quá trình tách chiết. Do đó, cách thu thập mẫu đúng và phương pháp xử lý tối ưu là rất quan trọng đối với sự thành công của việc tách chiết và ảnh hưởng tới tính chính xác của mẫu thu được. Với thể tích 1ml máu thường thu được 10 ng cfDNA và ở bệnh nhân ung thư, khoảng 0,01% đến 1% cfDNA là ctDNA (DNA của tế bào ung thư lưu hành). Một số phương pháp đã được sử dụng để phân lập ctDNA, bao gồm các phương pháp nhắm mục tiêu liên quan đến phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa trên các đột biến gen đã biết, ví dụ PCR kỹ thuật số; hạt, nhũ tương, khuếch đại và từ tính (BEAMing) PCR; và hệ thống đột biến khuếch đại-vật liệu chịu lửa-PCR. Ngoài ra, có các phương pháp có thể được sử dụng để giải trình tự hàng triệu đoạn DNA, bao gồm giải trình tự Sanger và các kỹ thuật giải trình tự gene thế hệ mới [31,32].
1- NHỮNG THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG CỦA HCC TRONG “DNA KHÔNG CÓ TẾ BÀO” (cfDNA).
Sinh thiết lỏng có thể phát hiện được những sự thay đổi về cả số lượng và chất lượng của cfDNA liên quan đến ung thư [33-37]. Ở những bệnh nhân bị HCC, tổng nồng độ cfDNA cao hơn đáng kể so với những người không mắc bệnh [33,34]. Mặc dù không đặc hiệu, dấu hiệu tăng cfDNA có khả năng hữu ích trong sàng lọc HCC, cũng như theo dõi đáp ứng điều trị và dự đoán tái phát HCC[34,38-40].
Yan và cộng sự [41] đã phân tích mức độ cfDNA và AFP từ 24 bệnh nhân mắc HCC và 62 bệnh nhân bị viêm gan B mãn tính với các mức độ xơ hóa khác nhau (F0 đến F6). Sử dụng phân tích đa biến, các tác giả nhận thấy tuổi và cfDNA là các yếu tố tiên lượng độc lập của HCC, trong khi AFP không phải là một yếu tố dự đoán độc lập. Họ đã phát triển một mô hình kết hợp bao gồm cấp độ cfDNA, tuổi và AFP, được gọi chung là chỉ số HCC, để chẩn đoán HCC bằng phân tích hồi quy logistic đảo ngược.
Chỉ số HCC có khoảng tin cậy 95%, độ nhạy 87% và độ đặc hiệu 100% trong chẩn đoán HCC với giá trị cắt là 0,61 [41], chứng tỏ sự vượt trội so với cfDNA đơn thuần hoặc AFP đơn thuần trong chẩn đoán HCC [41]. Sự kết hợp của mức cfDNA với các dấu ấn sinh học (protein hoặc di truyền khác) cho thấy sinh thiết lỏng cóthể là một công cụ lâm sàng trong chẩn đoán sớm HCC.
2- NHỮNG THAY ĐỔI CHẤT LƯỢNG CỦA HCC TRONG “DNA KHÔNG CÓ TẾ BÀO” (cfDNA).
Sinh thiết lỏng có thể phát hiện được sự thay đổi gen hoặc biểu sinh (sampling) trong cfDNA trong bệnh cảnh HCC và đây là những chỉ số đáng tin cậy về những thay đổi xảy ra trong các mô khối u.
Nói chung, những thay đổi này được nhóm lại gồm đột biến nucleotide đơn [35,42], thay đổi số lượng bản sao DNA [35,36], sắp xếp lại nhiễm sắc thể, mất dị hợp tử, satellite mất ổn định và thay đổi mô hình methyl hóa [37].
Đột biến nucleotide đơn:
Một nghiên cứu so sánh bộ gen của từng cặp mô khối u HCC với nhau đã chỉ ra rằng không có hai khối u mang cùng một loại đột biến soma [43]. Có sự thay đổi đáng kể về số lượng đột biến trong số những bệnh nhân bị HCC giai đoạn tiến triển. Soma đặc hiệu khối u đột biến ở một số gen đã được xác định trong máu ngoại vi của bệnh nhân HCC, bao gồm TP53 [44], HCK [45] và TERT[46].
Ba đột biến soma thường gặp nhất ở HCC là đột biến promoter TERT kích hoạt một số đột biến tìm thấy ở 40% đến 60% bệnh nhân HCC; và các đột biến TP53 và CTNNB1 (hai đột biến này không bao giờ xuất hiện đồng thời, nếu có đột biến này thì sẽ không xuất hiện đột biến còn lại) tìm thấy trong 30-50% trường hợp HCC [47-49]. Nghiên cứu PCR giọt nhỏ kỹ thuật số để phân tích các đột biến nucleotide đơn TERT c.-124C> T, TP53 c.747G> T (p.R249S), CTNNB1 c.121A>G (p.T41A) và c.133T> C (p.S45A) trong máu ngoại vi của bệnh nhân chủ yếu là HBV dương tính cho thấy 56% các bệnh nhân chứa ctDNA chứa các đột biến này [46]. Tuy nhiên, đột biến promoter TERT được tìm thấy ở cả bệnh nhân HCC cũng như bệnh nhân xơ gan không HCC, cho thấy đột biến này khó có thể là một dấu ấn sinh học cho HCC [50-52]. Mặt khác, đột biến TP53 xuất hiện đặc hiệu cho HCC và đã được xác định trong các mẫu huyết tương, huyết thanh và nước tiểu thu được từ bệnh nhân ung thư [53-57]. Đột biến TP53 phổ biến hơn ở HCC liên quan đến HBV và aflatoxin, so với HCC liên quan đến nguyên nhân khác. Một nghiên cứu dùng phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới phân tích ctDNA ở 14 bệnh nhân bị HCC tiến triển cho thấy đột biến CTNNB1 soma là đột biến phổ biến thứ hai và xảy ra ở 29% bệnh nhân [58].
CancerSEEK là xét nghiệm máu được phát triển gần đây, phát hiện 8 dấu ấn sinh học protein liên quan đến khối u và đột biến (bao gồm cả sự thay thế base đơn) ở 1933 vị trí gen khác biệt [59].
Xét nghiệm đã được sử dụng từ 812 đối chứng khỏe mạnh và 192 bệnh ung thư vú không di căn, ung thư đại trực tràng, thực quản, gan, phổi, buồng trứng, tuyến tụy và dạ dày [59]. Trong số 44 bệnh nhân bị HCC, xét nghiệm cho thấy độ nhạy 98% và độ đặc hiệu 99% trong phát hiện ung thư. Nhìn chung, xét nghiệm đã phát hiện năm loại ung thư với độ nhạy từ 69% đến 98% và độ đặc hiệu trên 99%. Ngoài ra, tính hiệu quả của CancerSEEK ở những bệnh nhân HCC khác biệt như thế nào với những bệnh nhân có nguy cơ cao khác, ví dụ những bệnh nhân bị xơ hóa tiến triển hoặc xơ gan, vẫn chưa được nghiên cứu.
Sắp xếp lại nhiễm sắc thể:
Ono và cộng sự [60] sử dụng phương pháp giải trình tự toàn bộ gen đã kết luận rằng việc sắp xếp lại bộ gen liên quan đến khối u HCC. Sau đó, họ xác nhận một số sắp xếp lại này bằng phương pháp PCR bằng cách sử dụng ctDNA phân lập trước phẫu thuật từ máu ngoại vi của bệnh nhân HCC và mồi được thiết kế để phát hiện điểm gián đoạn của sắp xếp lại nhiễm sắc thể nhìn thấy trong mô khối u. Các tác giả thấy rằng trước phẫu thuật ctDNA từ 7 bệnh nhân HCC cho thấy một số lần xóa, đảo ngược, sao chép song song và chuyển vị trong mô khối u HCC [60]. Sắp xếp lại nhiễm sắc thể có khả năng trở thành một dấu hiệu xét nghiệm sớm, không xâm lấn đối với HCC.
Sự biến thể số lượng bản sao:
Giải trình tự song song băng thông lớn Shotgun (Massively Parallel Sequencing – MPS) đã được sử dụng để xác định số lượng bản sao liên quan đến mô khối u của 4 bệnh nhân HCC và trong huyết tương trước và sau cắt bỏ khối u của họ, so với 16 người lành mạnh [35]. sự biến đổi các số lượng đặc trưng trong mô khối u đã được phản ánh trong các mẫu huyết tương trước khi cắt, và đã bị mất đi trong các mẫu huyết tương sau cắt bỏ.
Trong một nghiên cứu khác, phân tích MPS về kích thước ctDNA huyết tương ở 90 bệnh nhân HCC so với bệnh nhân viêm gan B mãn tính (n = 67), viêm gan xơ gan liên quan đến HBV (n = 36) và nhóm khỏe mạnh (n = 32) cho thấy huyết tương HCC chứa nhiều DNA ngắn và dài bất thường [36]. Các ctDNA ngắn ưu tiên mang theo bản sao liên quan đến khối u. Trong số 90 bệnh nhân HCC, 76 (84%) bệnh nhân có ít nhất một bản sao bị sai ở cấp độ nhiễm sắc thể trên NST 1 hoặc 8.
Ngoài ra, huyết tương bệnh nhân HCC có nhiều DNA ti thể mặc dù ngắn hơn nhiều so với DNA hạt nhân [36]. cfDNA bệnh nhân HCC ngắn hơn và phân mảnh hơn ở bệnh nhân không mắc bệnh gan hoặc với các bệnh gan không ác tính [36,61].
Mất dị hợp tử và mất ổn định microsatellite:
Pang et al.[62] đã sử dụng ba điểm đánh dấu nằm trên nhiễm sắc thể 8p: D8S277, D8S298 và D8S1771 để kiểm tra khả năng mất dị hợp tử (LOH) và mất ổn định microsatellite. Bằng cách phân tích cfDNA huyết tương và các mô khối u từ 62 bệnh nhân HCC, họ đã kiểm tra các đặc điểm của các lỗi này trong máu ngoại vi và xác định sự phù hợp của chúng với mô khối u. Đa số bệnh nhân mang theo sự bất ổn của microsatellite trong các mẫu huyết tương tại cùng một vị trí với các mô HCC tương ứng, với tỷ lệ phù hợp khoảng 73% [63]. Phát hiện này cho thấy sự thay đổi mất dị hợp tử (LOH) và mất ổn định microsatellite có thể dùng trong chẩn đoán không xâm lấn HCC, tuy nhiên những thay đổi này thường xảy ra ít hơn các thay đổi gen khác, và cần thiết nghiên cứu thêm để phân định khả năng ứng dụng lâm sàng của những thay đổi này.
Thay đổi trong methyl hóa DNA:
Methyl hóa DNA, một trong những sửa đổi biểu sinh được biết đến và nghiên cứu sớm nhất, thay đổi cấu trúc chromatin, sự ổn định DNA và tương tác DNA-protein để sửa đổi biểu hiện gen. Các sự kiện methyl hóa xảy ra rất sớm trong quá trình gây ung thư do đó thường được phát hiện ở các trạng thái tiền ung thư. Cho đến nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự thay đổi methyl hóa DNA ở một số gen có liên quan đến sự khởi đầu và tiến triển của HCC, bao gồm p15 và p16 [64], APC [65], SPINT2 [66], SFRP1 [67], TFP12 [68] ], GSTP1 [69] và RASSF1A [70]. HCC liên quan đến NAFLD có liên quan đến quá trình tăng cường methyl hóa của promoter của glycine Nmethyltransferase (GNMT), dẫn đến giảm biểu hiện gen [71]. Thêm nữa, người ta cũng quan sát thấy sự giảm methyl hóa trong HCC, và gây ra một số quá trình dẫn đến kích hoạt transposon, mất ổn định nhiễm sắc thể và tạo ra các biến thể số lượng bản sao. Sự giảm methyl hóa các chuỗi DNA lặp đi lặp lại bằng các “long interspersed nucleotide elements 1” (LINE-1) đã được phát hiện trong huyết tương của bệnh nhân bị HCC [72]. Đồng thời, người ta cũng đã chứng minh được sự kết hợp methyl hóa của một số “gen ức chế khối u” (tumor suppressor genes) giữa huyết tươngHCC và mô khối u.
Wong và cộng sự [37] cho thấy 25% bệnh nhân bị methyl hóa p15 trong mô và p15 bị methyl hóa trong mẫu máu và gần như tất cả bệnh nhân bị methyl hóa p15 và p16 trong các mô đã cho thấy sự bất thường methyl hóa trong mẫu máu. Điều quan trọng là, bệnh nhân bị methyl hóa p15 và p16 đã phát triển di căn hoặc tái phát HCC sau khi điều trị, cho thấy rằng phân tích methyl hóa p15 / p16 trong cfDNA có nguồn gốc từ máu ngoại vi có thể là dấu ấn để dự đoán sự di căn hoặc tái phát của HCC.
RASSF1A, một thành viên của nhóm Ras là một chất ức chế u thường im lặng trong bệnh ác tính do sự tăng cường methyl hóa (hypermethylation). Phân tích huyết thanh cho thấy 90% bệnh nhân HCC và 62,5% bệnh nhân HCV chứng minh tăng methyl hóa RASSF1A, so với 10% trong huyết thanh cua người bình thường [73].
Những nghiên cứu này cho thấy sự thay đổi methyl hóa đặc trưng của HCC có thể được xác định một cách đáng tin cậy trong các mẫu máu ngoại vi và có khả năng là dấu ấn sinh học để chẩn đoán và tiên lượng HCC.
KẾT LUẬN
Phân tích sinh thiết lỏng của huyết thanh và huyết tương cung cấp thông tin đáng tin cậy về sự thay đổi di truyền và biểu sinh trong mô khối u HCC, có thể thay thế cho xét nghiệm sinh thiết gan. Do tính rất không đồng nhất của HCC, một dấu ấn sinh học đơn lẻ sẽ thiếu độ nhạy và độ đặc hiệu cần thiết để chẩn đoán HCC, do đó một nhóm xét nghiệm bao gồm xác định nhiều đột biến và biểu sinh, kết hợp với dấu ấn sinh học protein, sẽ có tiện ích chẩn đoán tốt hơn. Một trong những xét nghiệm như vậy là CancerSEEK, cho phép phát hiện 8 dấu ấn sinh học protein và đột biến gen ở 1933 vị trí gen khác biệt, với độ nhạy 98% và độ đặc hiệu 99% để phát hiện HCC [59].
REFERENCES
1. Banini BA, Roberts LR. Hepatocellular carcinoma. Complications of Cirrhosis: Evaluation and management. Springer International Publishing; 2015. pp. 1-370.
2. Altekruse SF, McGlynn KA, Reichman ME. Hepatocellular carcinoma incidence, mortality, and survival trends in the United States from 1975 to 2005. J Clin Oncol 2009;27:1485-91.
3. Punnoose EA, Atwal SK, Spoerke JM, Savage H, Pandita A, et al. Molecular biomarker analyses using circulating tumor cells. PLoS One 2010;5:e12517.
4. Crowley E, Di Nicolantonio F, Loupakis F, Bardelli A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat Rev Clin Oncol 2013;10:472-84.
5. Hirai H, Taketa K. Lectin affinity electrophoresis of alpha-fetoprotein. Increased specificity and sensitivity as a marker of hepatocellular carcinoma. J Chromatogr 1992;604:91-4.
6. Bruix J, Sherman M, American Association for the Study of Liver D. Management of
hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology 2011;53:1020-2.
7. Marrero JA, Feng Z, Wang Y, Nguyen MH, Befeler AS, et al. Alpha-fetoprotein, des-gamma carboxyprothrombin, and lectin-bound alpha-fetoprotein in early hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2009;137:110-8.
8. Lok AS, Sterling RK, Everhart JE, Wright EC, Hoefs JC, et al. Des-gamma-carboxy prothrombin and alpha-fetoprotein as biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2010;138:493-502.
9. Farinati F, Marino D, De Giorgio M, Baldan A, Cantarini M, et al. Diagnostic and prognostic role of alpha-fetoprotein in hepatocellular carcinoma: both or neither? Am J Gastroenterol 2006;101:524-32.
10. Mandel P, Metais P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme. C R Seances Soc Biol Fil 1948;142:241-3.
11. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977;37:646-50.
12. Vasioukhin V, Anker P, Maurice P, Lyautey J, Lederrey C, et al. Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. Br J Haematol 1994;86:774-9.
13. Cachia PG, Taylor C, Thompson PW, Tennant GB, Masters G, et al. Non-dysplastic
myelodysplasia? Leukemia 1994;8:677-81.
14. Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, et al. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994;3:67-71.
15. Matsumura M, Shiratori Y, Niwa Y, Tanaka T, Ogura K, et al. Presence of alpha-fetoprotein mRNA in blood correlates with outcome in patients with hepatocellular carcinoma. J Hepatol 1999;31:332-9.
16. Cillo U, Navaglia F, Vitale A, Molari A, Basso D, et al. Clinical significance of alpha-fetoprotein mRNA in blood of patients with hepatocellular carcinoma. Clin Chim Acta 2004;347:129-38.
17. Jeng KS, Sheen IS, Tsai YC. Does the presence of circulating hepatocellular carcinoma cells indicate a risk of recurrence after resection? Am J Gastroenterol 2004;99:1503-9.
18. Xu H, Dong X, Chen Y, Wang X. Serum exosomal hnRNPH1 mRNA as a novel marker for
hepatocellular carcinoma. Clin Chem Lab Med 2018;56:479-84.
19. Mitchell PS, Parkin RK, Kroh EM, Fritz BR, Wyman SK, et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:10513-8.
20. Zheng Q, Zhao J, Yu H, Zong H, He X, et al. Tumor-specific transcripts are frequently
expressed in hepatocellular carcinoma with clinical implication and potential function. Hepatology 2019; doi: 10.1002/hep.30805.
21. Koduru SV, Leberfinger AN, Kawasawa YI, Mahajan M, Gusani NJ, et al. Non-coding RNAs in various stages of liver disease leading to hepatocellular carcinoma: differential expression of miRNAs, piRNAs, lncRNAs, circRNAs, and sno/mt-RNAs. Sci Rep 2018;8:7967.
22. Tian XP, Wang CY, Jin XH, Li M, Wang FW, et al. Acidic microenvironment up-regulates
exosomal miR-21 and miR-10b in earlystage hepatocellular carcinoma to promote cancer cell proliferation and metastasis. Theranostics 2019;9:1965-79.
23. Koberle V, Kronenberger B, Pleli T, Trojan J, Imelmann E, et al. Serum microRNA-1 and
microRNA-122 are prognostic markers in patients with hepatocellular carcinoma. Eur J Cancer 2013;49:3442-9.
24. Qu KZ, Zhang K, Li H, Afdhal NH, Albitar M. Circulating microRNAs as biomarkers for
hepatocellular carcinoma. J Clin Gastroenterol 2011;45:355-60.
25. Ge W, Yu DC, Li QG, Chen X, Zhang CY, et al. Expression of serum miR-16, let-7f, and miR-21 in patients with hepatocellular carcinoma and their clinical significances. Clin Lab 2014;60:427-34.
26. El-Abd NE, Fawzy NA, El-Sheikh SM, Soliman ME. Circulating miRNA-122, miRNA-199a, and miRNA-16 as biomarkers for early detection of hepatocellular carcinoma in egyptian patients with chronic hepatitis C virus infection. Mol Diagn Ther 2015;19:213-20.
27. Qi P, Cheng SQ, Wang H, Li N, Chen YF, et al. Serum microRNAs as biomarkers for
hepatocellular carcinoma in Chinese patients with chronic hepatitis B virus infection. PLoS One 2011;6:e28486.
28. Liu M, Liu J, Wang L, Wu H, Zhou C, et al. Association of serum microRNA expression in
hepatocellular carcinomas treated with transarterial chemoembolization and patient survival. PLoS One 2014;9:e109347.
29. Zekri AN, Youssef AS, El-Desouky ED, Ahmed OS, Lotfy MM, et al. Serum microRNA panels as potential biomarkers for early detection of hepatocellular carcinoma on top of HCV infection. Tumour Biol 2016;37:12273-86.
30. Mirzaei HR, Sahebkar A, Mohammadi M, Yari R, Salehi H, et al. Circulating microRNAs in hepatocellular carcinoma: potential diagnostic and prognostic biomarkers. Curr Pharm Des 2016;22:5257-69.
31. Forshew T, Murtaza M, Parkinson C, Gale D, Tsui DW, et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci Transl Med 2012;4:136ra68.
32. Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, et al. An ultrasensitive method for
quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat Med 2014;20:548-54.
33. Chen H, Sun LY, Zheng HQ, Zhang QF, Jin XM. Total serum DNA and DNA integrity: diagnostic value in patients with hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma. Pathology 2012;44:318-24.
34. Huang Z, Hua D, Hu Y, Cheng Z, Zhou X, et al. Quantitation of plasma circulating DNA using quantitative PCR for the detection of hepatocellular carcinoma. Pathol Oncol Res 2012;18:271-6.
35. Chan KC, Jiang P, Zheng YW, Liao GJ, Sun H, et al. Cancer genome scanning in plasma:
detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin Chem 2013;59:211-24.
36. Jiang P, Chan CW, Chan KC, Cheng SH, Wong J, et al. Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112:E1317-25.
37. Wong IH, Lo YM, Yeo W, Lau WY, Johnson PJ. Frequent p15 promoter methylation in tumor and peripheral blood from hepatocellular carcinoma patients. Clin Cancer Res 2000;6:3516-21.
38. Ren N, Qin LX, Tu H, Liu YK, Zhang BH, et al. The prognostic value of circulating plasma DNA level and its allelic imbalance on chromosome 8p in patients with hepatocellular carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2006;132:399-407.
39. Iizuka N, Sakaida I, Moribe T, Fujita N, Miura T, et al. Elevated levels of circulating cell-free DNA in the blood of patients with hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma. Anticancer Res 2006;26:4713-9.
40. Piciocchi M, Cardin R, Vitale A, Vanin V, Giacomin A, et al. Circulating free DNA in the
progression of liver damage to hepatocellular carcinoma. Hepatol Int 2013;7:1050-7.
41. Yan L, Chen Y, Zhou J, Zhao H, Zhang H, et al. Diagnostic value of circulating cell-free DNA levels for hepatocellular carcinoma. Int J Infect Dis 2018;67:92-7.
42. Szymanska K, Chen JG, Cui Y, Gong YY, Turner PC, et al. TP53 R249S mutations, exposure to aflatoxin, and occurrence of hepatocellular carcinoma in a cohort of chronic hepatitis B virus carriers from Qidong, China. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009;18:1638-43.
43. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, Kinde I, Wang Y, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med 2014;6:224ra24.
44. Yu L, Liu X, Han C, Lu S, Zhu G, et al. XRCC1 rs25487 genetic variant and TP53 mutation at codon 249 predict clinical outcomes of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma after hepatectomy: a cohort study for 10 years’ follow up. Hepatol Res 2016;46:765-74.
45. Cai ZX, Chen G, Zeng YY, Dong XQ, Lin MJ, et al. Circulating tumor DNA profiling reveals clonal evolution and real-time disease progression in advanced hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 2017;141:977-85.
46. Huang A, Zhang X, Zhou SL, Cao Y, Huang XW, et al. Detecting circulating tumor DNA in hepatocellular carcinoma patients using droplet digital PCR is feasible and reflects intratumoral heterogeneity. J Cancer 2016;7:1907-14.
47. Nault JC, Zucman-Rossi J. Genetics of hepatocellular carcinoma: the next generation. J Hepatol 2014;60:224-6.
48. Kan Z, Zheng H, Liu X, Li S, Barber TD, et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in hepatocellular carcinoma. Genome Res 2013;23:1422-33.
49. Fujimoto A, Totoki Y, Abe T, Boroevich KA, Hosoda F, et al. Whole-genome sequencing of liver cancers identifies etiological influences on mutation patterns and recurrent mutations in chromatin regulators. Nat Genet 2012;44:760-4.
50. Nault JC, Mallet M, Pilati C, Calderaro J, Bioulac-Sage P, et al. High frequency of telomerase reverse-transcriptase promoter somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions. Nat Commun 2013;4:2218.
51. Nault JC, Calderaro J, Di Tommaso L, Balabaud C, Zafrani ES, et al. Telomerase reverse
transcriptase promoter mutation is an early somatic genetic alteration in the transformation of premalignant nodules in hepatocellular carcinoma on cirrhosis. Hepatology 2014;60:1983-92.
52. Pinyol R, Tovar V, Llovet JM. TERT promoter mutations: gatekeeper and driver of
hepatocellular carcinoma. J Hepatol 2014;61:685-7.
53. Hann HW, Jain S, Park G, Steffen JD, Song W, et al. Detection of urine DNA markers for
monitoring recurrent hepatocellular carcinoma. Hepatoma Res 2017;3:105-11.
54. Hosny G, Farahat N, Tayel H, Hainaut P. Ser-249 TP53 and CTNNB1 mutations in circulating free DNA of Egyptian patients with hepatocellular carcinoma versus chronic liver diseases. Cancer Lett 2008;264:201-8.
55. Kuang SY, Lekawanvijit S, Maneekarn N, Thongsawat S, Brodovicz K, et al. Hepatitis B
1762T/1764A mutations, hepatitis C infection, and codon 249 p53 mutations in hepatocellular carcinomas from Thailand. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:380-4.
56. Szymanska K, Lesi OA, Kirk GD, Sam O, Taniere P, et al. Ser-249TP53 mutation in tumour and plasma DNA of hepatocellular carcinoma patients from a high incidence area in the Gambia, West Africa. Int J Cancer 2004;110:374-9.
57. Lleonart ME, Kirk GD, Villar S, Lesi OA, Dasgupta A, et al. Quantitative analysis of plasma TP53 249Ser-mutated DNA by electrospray ionization mass spectrometry. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:2956-62.
58. Ikeda S, Tsigelny IF, Skjevik AA, Kono Y, Mendler M, et al. Next-generation sequencing of circulating tumor DNA reveals frequent alterations in advanced hepatocellular carcinoma.
Oncologist 2018;23:586-93.
59. Cohen JD, Li L, Wang Y, Thoburn C, Afsari B, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 2018;359:926-30.
60. Ono A, Fujimoto A, Yamamoto Y, Akamatsu S, Hiraga N, et al. Circulating tumor DNA analysis for liver cancers and its usefulness as a liquid biopsy. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 2015;1:516-34.
61. Huang A, Zhang X, Zhou SL, Cao Y, Huang XW, et al. Plasma Circulating cell-free DNA integrity as a promising biomarker for diagnosis and surveillance in patients with hepatocellular carcinoma. J Cancer 2016;7:1798-803.
62. Pang JZ, Qin LX, Wang QQ, Ren N, Sun BS, et al. Loss of heterozygosity of plasma circulating DNA from hepatocellular carcinoma patients and its clinical significance. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi 2007;15:906-9.
63. Pang JZ, Qin LX, Ren N, Ye QH, Ying WD, et al. Microsatellite alterations of circulating DNA in the plasma of patients with hepatocellular carcinoma. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2006;86:1662-5.
64. Zhang YJ, Wu HC, Shen J, Ahsan H, Tsai WY, et al. Predicting hepatocellular carcinoma by detection of aberrant promoter methylation in serum DNA. Clin Cancer Res 2007;13:2378-84.
65. Iyer P, Zekri AR, Hung CW, Schiefelbein E, Ismail K, et al. Concordance of DNA methylation pattern in plasma and tumor DNA of Egyptian hepatocellular carcinoma patients. Exp Mol Pathol 2010;88:107-11.
66. Iizuka N, Oka M, Sakaida I, Moribe T, Miura T, et al. Efficient detection of hepatocellular
carcinoma by a hybrid blood test of epigenetic and classical protein markers. Clin Chim Acta 2011;412:152-8.
67. Huang ZH, Hu Y, Hua D, Wu YY, Song MX, et al. Quantitative analysis of multiple methylated genes in plasma for the diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Exp Mol Pathol 2011;91:702-7.
68. Sun FK, Fan YC, Zhao J, Zhang F, Gao S, et al. Detection of TFPI2 methylation in the serum of hepatocellular carcinoma patients. Dig Dis Sci 2013;58:1010-5.
69. Chang H, Yi B, Li L, Zhang HY, Sun F, et al. Methylation of tumor associated genes in tissue and plasma samples from liver disease patients. Exp Mol Pathol 2008;85:96-100.
70. Yeo W, Wong N, Wong WL, Lai PB, Zhong S, et al. High frequency of promoter
hypermethylation of RASSF1A in tumor and plasma of patients with hepatocellular carcinoma. Liver Int 2005;25:266-72.
71. Borowa-Mazgaj B, de Conti A, Tryndyak V, Steward CR, Jimenez L, et al. Gene expression and DNA methylation alterations in the glycine N-methyltransferase gene in diet-induced nonalcoholic fatty liver disease-associated carcinogenesis. Toxicol Sci 2019; doi: 10.1093/toxsci/kfz110.
72. Tangkijvanich P, Hourpai N, Rattanatanyong P, Wisedopas N, Mahachai V, et al. Serum LINE-1 hypomethylation as a potential prognostic marker for hepatocellular carcinoma. Clin Chim Acta
2007;379:127-33.
73. Mohamed NA, Swify EM, Amin NF, Soliman MM, Tag-Eldin LM, et al. Is serum level of
methylated RASSF1A valuable in diagnosing hepatocellular carcinoma in patients with chronic viral hepatitis C? Arab J Gastroenterol 2012;13:111-5.
74. Xu RH, Wei W, Krawczyk M, Wang W, Luo H, et al. Circulating tumour DNA methylation
markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater 2017;16:1155-61.
Trân trọng cảm ơn!
